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Spettrofotometria
Le tecniche spettroscopiche si basano sulla misura delle radiazioni assorbite ed emesse dalla materia. La spettrofotometria fa parte dei metodi spettroscopici ed è la tecnica che determina la quantità di luce assorbita da composti colorati e non, poiché è una tecnica che lavora nella luce visibile e ultravioletta. Viene usata per la analisi qualitativa e quantitativa dei composti.
La radiazione elettromagnetica
La radiazione elettromagnetica è composta da un onda che rappresenta il vettore elettrico e da una che rappresenta il vettore magnetico che oscillano su piani tra loro ortogonali e perpendicolari alla direzione di propagazione.
L’energia, la frequenza, la lunghezza d’onda e l’intensità (l’altezza della cresta) sono proprietà dei fenomeni elettromagnetici che possono essere dovuti sia a fenomeni ondulatori sia a particelle dette fotoni o quanti.
n= c/l
n = frequenza della radiazione elettromagnetica (cicli/s, ossia s-1, Hertz, Hz)
l= lunghezza d’onda→ distanza tra due creste o due valli, in genere si usa i nm, ma è meglio m.
c = velocità della luce (299’792’458 m/s nel vuoto, approssimata 3x108m/s)
L’ onda elettromagnetica è sempre collegata ad un energia : E= hn
dove h = costante di Planck (6.63 x 10-34Js), quindi è evidente che ad ogni frequenza è associata un energia e sono direttamente proporzionali per cui maggiore è la frequenza, maggiore è l’energia.
Al diminuire della lunghezza d’onda aumentano la frequenza e l’energia.
TRANSIZIONE ELETTRONICA
La spettrofotometria UV-vis osserva le transizioni elettroniche.
La transizione elettronica è il passaggio di un elettrone dallo stato fondamentale allo stato eccitato a seguito di energia fornita al sistema, energia che deriva da una radiazione elettromagnetica:
∆E = E1-E2 = hn
∆E = variazione del livello energetico dell’elettrone o energia della radiazione elettromagnetica assorbita o emessa da un atomo o molecola
E1 = energia dell’elettrone al livello iniziale → stato fondamentale
E2 = energia dell’elettrone al livello finale → stato eccitato
h = costante di Planck (6.63 x 10-34J s)
n= frequenza della radiazione elettromagnetica
Per ogni ∆E c’è una sola frequenza corrispondente a cui l’elettrone si eccita. Per passare al livello superiore, l’elettrone assorbe energia dal sistema, si ha perciò uno spettro di assorbimento. Lo stato eccitato è transitorio e quando torna allo stato fondamentale emette un quanto di energia pari a quella assorbita e rilascia uno spettro di emissione. Questa energia può essere rilasciata sotto altre forme. Poiché i livelli energetici sono suddivisi in sottolivelli si ottiene spettri a bande.
I colori complementari
Le sostanze ci appaiono colorate perché noi vediamo la luce riflessa dagli oggetti; luce non è composta da una sola lunghezza d’onda ma è policromatica ossia è composta dai colori che vanno dal rosso al violetto. La luce bianca (policromatica) è la somma di tutte le frequenze dello spettro visibile, ci appare bianca perché perdo il colore nel mescolarsi di tutte le lunghezze d’onda e un dato oggetto è di questo colore quando assorbe completamente la luce e riflette tutte le lunghezze d’onda.
Una sostanza che assorbe un colore appare del suo colore complementare. Per cui oggetto che assorbe giallo riflette tutti gli altri colori, ma il viola è sbilanciato poiché non ha più il suo complementare e appare di questo colore.
Nelle molecole avviene a livello degli elettroni che compongono la materia. Le molecole che assorbono grazie alle transizioni degli elettroni nell’UV-visibile sono i cromofori → si intende un raggruppamento chimico insaturo che risulta responsabile di un assorbimento caratteristico situato nella regione di lunghezza d’onda compresa tra 180 e 1000 nm. I cromofori più semplici sono costituiti da gruppi organici quali l’etilenico, l’acetilenico, il carbonilico, il carbossilico, l’azoico, il nitrico, il nitroso, il solfossido, ecc…
In spettrofotometria si possono sfruttare sia i cromofori propri della molecola in osservazione nel caso ne abbia di propri o è possibile attaccargliene altri che si coniugano in maniera specifica alla molecola oggetto d’indagine.
I cromofori si dividono tra quelli a effetto:
-batocromo o red shift → spostano lo spettro verso lunghezze d’onda maggiori, ossia verso il rosso
-ipsocromo o blue shift→ spostano lo spettro verso lunghezze d’onda minori, ossia verso il blu
Oppure posso aver effetto:
- ipercromico→ quando provocano aumento dell’intensità
- ipocromico → quando provocano diminuzione dell’intensità.
Spettroscopia nell’ultravioletto e nel visibile
•L'UV comprende raggi di l da 10 a 400 nm. Quando viene considerato l'effetto dei raggi UV sulla salute umana, si distinguono UV-A(400-315 nm), UV-B(315-280 nm) e UV-C(280-10 nm). Ovviamente i raggi UV-C sono i più pericolosi perchè essendo a lunghezza d’onda più bassa hanno frequenza e quindi energia più alta. A causa dell'assorbimento da parte dell’atmosfera terrestre, circa il 99% degli ultravioletti che arrivano sulla superficie terrestre sono UV-A.
•Il visibile comprende raggi di l da 400 a 800 nm.
•Le regioni dell’ultravioletto vicino e del visibile dello spettro elettromagnetico e le tecniche ad esse associate sono le più utilizzate sia per il lavoro analitico di routine che per la ricerca in campo biochimico
La legge di Lambert-Beer
Onda assorbita da un corpo è rilasciata con intensità minore. Per cui possiamo calcolare il grado di assorbnimento della luce da parte di una sostanza.
I0 = intensità della luce incidente
I1 = intensità della luce trasmessa
l = cammino ottico (1 cm) → spessore della sostanza/soluzione che viene attraversata
c = concentrazione della sostanza attraversata
T = trasmittanza = I1/I0
A = Assorbanza = log10(1/T) = log10 (I0/I) = DO, OD (densità ottica), E (Estinzione)
ελ (o a)= coefficiente di estinzione molare di una sostanza a una determinata lunghezza d’onda = Assorbanza di una soluzione 1 M
A = εlc l
Intensità: numero di fotoni che interagiscono nell’unità di tempo, secondi.
L’assorbanza è proporzionale sia alla concentrazione della sostanza assorbente che allo spessore dello strato attraversato.
Sostanza trasparente che non assorbe alcuna radiazione ha una trasmittanza del 100% (=1); una sostanza opaca che assorbe completamente la luce ha una trasmittanza pari a zero. Mentre la trasmittanza va da 0 a 100%, l’assorbanza va da 0 a 1 ed è adimensionale.
È valida solo quando usiamo radiazioni monocromatiche e la soluzione deve essere diluita o per lo meno deve essere in certi ambiti di concentrazione, infatti deve essere piccola.
La causa di non osservanza della legge possono essere di tipo chimico e strumentale.
Effetti chimici:
-cambiamenti nella struttura molecolare della sostanza assorbente che portano a modificazioni delle proprietà assorbenti della stessa
-indice di rifrazione può cambiare la concentrazione poiché l’onda incidente deve attraversare il campione e se viene rifratta in maniera differente a seconda della concentrazione è ovvio che la legge non è più applicabile
-alterazione del pH può portare a modificazione nell’associazione della sostanza assorbente
-assorbimento di luce da parte di altre sostanze presenti in soluzione
-effettuazione della misura a valori di concentrazione troppo elevati
Effetti fotometrici (strumentali):
-radiazioni non monocromatiche impiegate per la misura
-linearità degli strumenti
La legge di lamert-beer è valida quindi se la luce incidente è monocromatica, se l’assorbimento del solvente è trascurabile, se la concentrazione del campione è contenuta entro limiti adatti, se non si verificano reazioni chimiche delle molecole del campione fra loro o con il solvente.
SPETTROFOTOMETRI→ sono strumenti da banco che misurano il valore dell’assorbanza di una sostanza. Si dividono in due grandi gruppi:
- Lo SPETTROFOTOMETRO monoraggio è usato per l’analisi quantitativa, ma è più sensibile ad agenti esterni come la temperatura, la luce e la stessa misurazione del bianco che deve essere ripetuta per ogni misurazione. Le misure sono quindi meno accurate.
- Lo SPETTROFOTOMETRO a doppio raggio è più complesso e costoso, ma consente una grande precisione e praticità anche nelle analisi quantitative, poiché registra il bianco una sola volta e poi continua in automatico. E’assolutamente indicato nei dosaggi che richiedono più reazioni per ottenere il prodotto da esaminare.
Uno spettrofotometro è composto da:
1) SORGENTE di radiazione (lampade al Tungsteno→ emettono radiazioni vicine all’infrarosso e al visibile o al deuterio → emette luce ultravioletta)
2) SELETTORE di lunghezze d’onda o MONOCROMATORE che seleziona una delle tante lunghezze d’onda emesse dalla lampada
3) un PORTACUVETTE dove vengono inserite le CELLE che contengono il campione
4) RIVELATORE è un correttore che misura l’intensità della radiazione trasmessa (dei FORI che selezionano le radiazioni che vanno a colpire la cuvetta in quarzo)
5) LETTORE
STRUTTURA DI UNO SPETTROMETRO A DOPPIO RAGGIO
1) Lightsource (sorgente luminosa) → si usano una lampada a bassa intensità ma con luminosità costante nel tempo e con uno spettro il piu' possibile lineare. Per coprire tutto lo spettro sono spesso necessarie due o tre lampade
2) slit, una o più fenditure nello strumento permettono di ottenere fasci luminosi sottili e paralleli, più facili da focalizzare
3) monochromator, una volta si usava un prisma in quarzo, ora si usa un reticolo ad interferenza per scomporre la luce bianca nelle sue componenti cromatiche. Nei moderni spettrofotometri si può ottenere un fascio luminoso anche con frequenza di un solo nanometro(nm). Anche qui per coprire tutto lo spettro possono essere necessari due o più monocromatori
4) chopper, un insieme di specchi motorizzati che vibrando velocemente invia il raggio monocromatico in due portacuvette con intensità uguale nel tempo. Il raggio che esce dal monocromatore è sempre uno solo, ma viene riflesso una volta al campione una volta al bianco, molto velocemente e di continuo.
5) cuvette, degli opportuni contenitori per le soluzioni da misurare. Hanno due facce parallele trasparenti alle radiazioni utilizzate (di solito in quarzo ottico). Importante è il cammino ottico cioè la distanza fra le facce della cuvetta. Il raggio monocromatico attraversando la cuvetta interagisce con la soluzione e diminuisce la sua intensità.
6)sample-blank, abbiamo una sostanza di cui vogliamo misurare l’assorbanza, ma all’interno di questa sono contenute altre cose come acqua, tampone, sali, ecc… per cui è necessario utilizzare un campione bianco, ossia un campione che sia uguale a quello che vogliamo misurare, ma che sia privo dell’analita. Devono avere stesso pH e temperatura, stessi cromofori, ecc.
I due raggi vengono assorbiti percio' in maniera diversa;
7) un sistema di specchi, mobili, in via continuamente uno dopo l'altro i raggi al sistema di rivelazione ricostruendo quell'unico raggio che deve arrivare al rivelatore.
8) lightmeter, un fotorivelatore, lineare nello spettro utilizzato, provvede a leggere continuamente i due raggi e a fornire il valore differenza, cioe' la trasmittanza. Se lo spettro e' molto ampio possono essere necessari due o piu' rivelatori
9) computer, oggi un piccolo computer dedicato gestisce tutto lo strumento, l'apertura delle fenditure, la rotazione del reticolo, il movimento degli specchi e permette inoltre una prima elaborazione dei risultati.
Misurazione è continua nel tempo per cui, anche se dovesse variare di un pochino la temperatura, questo riesegue i calcoli in tempo reale ritrovando il valore dell’assorbanza.
Definizioni dei componenti:
SORGENTE → È la parte dell’apparecchio da cui prende origine la radiazione policromatica (contenenti cioè tutte le lunghezze d'onda del campo richiesto) che viene diretta sul campione.
Negli strumenti che misurano la luce visibile e l’ultravioletta, sono presenti due diverse lampade, in modo che la sorgente copra l’intervallo da 190–800 nm:
-per la regione del visibile si utilizzano lampade a incandescenza a filamento di tungsteno, lampade quarzo-iodio o lampade tungsteno-alogeno)
-per la regione UV si usano lampade a scarica in un gas (deuterio o a idrogeno);
Sono costituite da un'ampolla di quarzo contenente il gas rarefatto nella quale viene attivata, tra due elettrodi, una scarica elettrica con la conseguente emissione di radiazioni con spettro continuo.
Gli SPETTROFOTOMETRI UV-VISIBILE avranno quindi al loro interno queste due lampade, che vengono opportunamente intercambiate dal meccanismo interno. Il valore di “cambio–lampada” è in genere intorno a 350nm.
MONOCROMATORE → sistema ottico usato per disperdere la luce policromatica in bande monocromatiche, che vengono inviate in successione sul campione.
Essi sono basati su un ELEMENTO DISPERDENTE (prisma o reticolo), che separa le varie componenti della radiazione e permette la successiva selezione della banda desiderata.
Consiste nel far incidere il fascio policromatico su un oggetto (un prisma o un reticolo) in grado di deviare le diverse radiazioni con diversi angoli: la radiazione uscente sarà quella che passa attraverso la fenditura di uscita. Il reticolo funziona su interferenza, mentre il prisma funziona tramite l’indice di rifrazione. Quando luce incidente trova la superficie del prisma viene difratta e cambia indice di rifrazione, ossia il cammino cambia di un certo angolo. Quando il raggio riesce dal prisma viene difratta nuovamente e cambia direzione. Indice di rifrazione del mezzo trasparente cresce al diminuire della lunghezza d’onda, quindi il raggio incidente entra come un unico raggio e esce come tanti raggi divisi per lunghezza d’onda. Quelle lunghe (rosse) vengono poco rifratte, mentre quelle più piccole (violetto) vengono molto rifratte e vengono deviate molto di più.
CELLA→ Le pareti della cuvetta devono essere trasparenti per consentire il passaggio della luce che viene fatta passare attraverso le pareti lisce. In questa cuvetta viene inserito il campione (in soluzione) da esaminare. Solitamente hanno il cammino ottico di 1 cm per ristringere il volume nella direzione ortogonale al cammino ottico.
Poiché il vetro non è trasparente alla radiazione ultravioletta(UV), per quest’ultima si usa la cuvetta al quarzo. Le cuvette sono di due materiali polistirolo e quarzo:
♦ in UV si utilizzano celle in quarzo (SiO2), molto fragili e costose, non la plastica perche assorbe e non sarebbe più trasparente.
♦ nel VISIBILE in vetro o quarzo o alcuni materiali plastici (polistirolo).
RIVELATORE, RIELABORAZIONE E PRESENTAZIONE DEI DATI → E’ un dispositivo che misura i fotoni, ossia l’intensità e l’ampiezza dell’onda. E’ capace di produrre un segnale elettrico che dipende dall'energia delle radiazioni ricevuta.
Tale segnale elettrico (proporzionale all'intensità luminosa) viene poi trasferito a un indicatore Analogico. Il segnale proveniente dal rivelatore viene opportunamente amplificato e un amperometro ne rileva l’intensità. Il lettore converte quindi il segnale elettrico in un valore numerico proporzionale all’intensità del segnale, e questo valore va da 0 a 100.
Ponendo pari a 100 il valore del segnale in assenza del campione, otteniamo la trasmittanza e da questa l’assorbanza.
SPETTROFOTOMETRO A MONORAGGIO → bianco e campione non possono essere messi in contemporanea, per cui mettiamo prima la provetta col bianco ed effettuiamo la misura, dopo il campione e effettuiamo nuovamente la misura dell’assorbanza. Lo strumento a questo punto fa la differenza. Assorbanza è quindi misurata in due tempi e rende le misure un po’ meno precise, a causa di oscillazione di temperature o nella risposta del rilevatore.
SPETTROFOTOMETRO A DOPPIO RAGGIO → Il raggio viene spostato alternativamente dal campione al bianco per cui si posso mettere entrambi. Faccio migliaia di misure in quasi contemporanea e questo fa si che io elimini le oscillazioni dovute a temperature o altre interferenze.
ANALISI QUALITATIVA
Registrando l’assorbimento di una sostanza al variare della l, si ricava lo spettro di assorbimento, che costituisce una“impronta digitale” caratteristica di ogni sostanza. Es. identificazione di NAD - NADH →Si fa lo spettro di assorbimento di due soluzioni 10 mM, quindi si confrontano con gli spettri della bibliografia
ANALISI QUANTITATIVA
Una volta determinata la l ottimale (solitamente quella del picco), si può procedere all’analisi quantitativa di una sostanza con vari metodi:
- Se si ha a disposizione uno standard (non è il bianco, è un campione che contiene una concentrazione conosciuta di analita) a concentrazione nota ed è tollerabile un risultato approssimativo e non preciso: Concentrazione = Assorbanza del campione/ Assorbanza dello standard
-Se si ha a disposizione uno standard a concentrazione nota e si desidera un risultato accurato, si fa una curva di taratura e si interpola il dato per il campione sconosciuto → risultato più accurato
-Se si conosce la εl della sostanza e non sono presenti altre sostanze che assorbono a quella l :
C= A/ε
Solo se analita è puro e ε è nota in maniera precisa.
COSTRUZIONE DI CURVE DI TARATURA
-la sensibilità è massima al picco di estinzione del cromoforo
- a volte si preferisce un picco più specifico
- il bianco deve contenere tutti i reagenti, tranne la sostanza da determinare
-occorrono almeno cinque punti, misurai in doppio
- non si deve estrapolare la curva oltre il valore più alto determinato
Prendo concentrazioni note dell’analita e per ciascuno misuro l’assorbanza, se e solo se sono nel campo di linearità della legge di lambert- beel la curva di taratura dovrebbe venire una retta. Misuro assorbanza del mio campione e per intersecazione con la retta trovo la concentrazione.
Si misura al picco di assorbimento poiche se abbiamo piccole variazioni della lunghezza d’onda nelle nostre misurazioni, ci può essere una grande differenza nella risposta se non siamo a l massima.
CRITERI DI SCELTA IN UN METODO COLORIMETRICO
-specificità della reazione
-campo di proporzionalità A/[C]
- stabilità del colore
-riproducibilità
-limpidità della soluzione
-sensibilità
-convenienza
Fonte: http://it-it.abctribe.com/download/appunti/Estratti_appunti/32305-XFRRDIFQXE_20130715114350.docx
Sito web da visitare: http://it-it.abctribe.com/
Autore del testo: indicato nel documento di origine
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"Ciò che sappiamo è una goccia, ciò che ignoriamo un oceano!" Isaac Newton. Essendo impossibile tenere a mente l'enorme quantità di informazioni, l'importante è sapere dove ritrovare l'informazione quando questa serve. U. Eco
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