LINEE GUIDA PER LA DIAGNOSI MOLECOLARE DELL’ATROFIA MUSCOLARE SPINALE (SMA)
Definizione e classificazione

L'Atrofia Muscolare Spinale (SMA) è una della più comuni malattie autosomiche recessive. È caratterizzata da debolezza muscolare progressiva prossimale e simmetrica, causata dalla degenerazione del secondo motoneurone nel corno anteriore del midollo spinale. Non si osservano segni di coinvolgimento del sistema sensitivo e del tratto piramidale (primo motoneurone). La sua incidenza è di circa 1/10000 nati vivi [Thieme A. et al. 1993; Pearn J 1978; Pearn JH 1973; Czeizel A. 1991; Burd L. et al. 1991]; la frequenza dei portatori è di 1/40-1/60 nella popolazione generale [Pearn et al. 1980; Melki et al. 1994].
La classificazione clinica, è basata sull’età d’insorgenza, la gravità della forma stabilita sulla migliore acquisizione motoria raggiunta e l’età dell’exitus (Tabella 1) [Munsat TL and Davies KE. International SMA consortium meeting Neuromuscul Disord. 1992]. Tale classificazione risulta utile per un corretto inquadramento diagnostico, per la prognosi e il follow-up della malattia. Vengono distinte tre diverse forme:
La SMA di tipo I (OMIM #253300, forma infantile acuta o malattia di Werdnig-Hoffmann) rappresenta la principale causa di morte per malattie genetiche nei primi due anni di vita. La malattia esordisce entro i primi 6 mesi di vita, ma sono descritti numerosi casi in cui la madre o il medico che esegue l’ecografia riferiscono una riduzione dei movimenti fetali. Il bambino si presenta ipotonico, con postura “a rana”, con tendenza a giacere con braccia e gambe addotte, incapace di cambiare posizione o di sostenere il capo. Un segno tipico della malattia è la respirazione diaframmatica, resa evidente dalla distensione dell’addome durante l’inspirazione. Il pianto è flebile e la suzione è debole. L’elettromiografia (EMG) evidenzia i segni di una grave denervazione con potenziali di fibrillazione ad alta intensità e bassa frequenza, mentre la biopsia muscolare, considerata attualmente obsoleta dopo la possibilita’ di una diagnosi molecolare, rivela la presenza di piccoli gruppi di fibre ipertrofiche associati ad estesi raggruppamenti di piccole fibre atrofiche scarsamente differenziate.
La SMA di tipo II (OMIM #253550, forma infantile cronica o SMA di tipo intermedio), esordisce solitamente intorno tra i 6 e i 18 mesi di vita. Il paziente acquista la capacità di reggere il capo e di sedersi, ma non riesce mai ad alzarsi o a reggersi in piedi in maniera autonoma. Analogamente a quanto avviene nella forma di tipo I, la debolezza muscolare è simmetrica e riguarda soprattutto gli arti inferiori. Il paziente può presentare fascicolazioni della lingua, e in alcuni casi, anche tremore delle mani. Conseguentemente al danno muscolare si osserva in questi pazienti, come in quelli con SMA III, un aumento moderato dei livelli della creatinchinasi nel siero. Dopo l’iniziale sviluppo dell’atrofia, il deterioramento delle condizioni del malato può risultare lento o episodico. Le misure da adottare fanno dunque riferimento alla prevenzione delle infezioni respiratorie (dalle quali dipende la prognosi), e della scoliosi che sopravviene nella quasi totalita’ dei pazienti e può diventare fortemente invalidante se non è trattata precocemente [Dubowitz V, 1995].
La SMA di tipo III (OMIM #253400, forma giovanile o malattia di Kugelberg-Welander ), esordisce dopo il diciottesimo mese di vita, quando diventa evidente una debolezza dei muscoli della coscia e dell’anca. L’andatura anserina e i piedi piatti, atteggiati in valgismo, sono caratteristici rispetto alla postura dei malati distrofici. Due segni tipici completano il quadro clinico, la marcata lordosi lombare posturale per l’atrofia dei muscoli del cingolo pelvico, e la manovra di Gower alla quale il bambino ricorre per sollevarsi da terra. La prognosi è buona poiché nella maggior parte dei casi la capacità di camminare viene mantenuta per molti anni, e a volte si assiste ad un parziale recupero funzionale per reinnervazione compensatoria. La fisioterapia, come il contenimento del peso con una dieta opportuna, migliorano sensibilmente la qualità della vita e ritardano il declino funzionale [Dubowitz V, 1995].
Esiste inoltre una rara forma ad esordio in età adulta (SMA IV; OMIM #), geneticamente eterogenea, che può presentare lo stesso difetto genetico responsabile delle SMA I, II e III [Brahe et al., 1995].

 

	OMIM	Età di insorgenza	Tappe dello sviluppo motorio	Aspettativa di vita	Altro
SMA di tipo 1	#253300	0-6 mesi	Posizione seduta autonoma: no Stazione eretta e/o deambulazione autonoma: no	Morte entro i due anni di vita in più del 95% dei casi (età media alla morte=8 mesi)	Lievi contratture delle articolazioni Debolezza dei muscoli facciali minima o assente Difficoltà di suzione e deglutizione variabili
SMA di tipo 2	#253550	Entro i 18 mesi (età media di esordio: 8 mesi)	Posizione seduta autonoma: si Stazione eretta e/o deambulazione autonoma: no	Morte dopo i due anni di vita (75% di probabilità di sopravvivenza a 20 anni)	Tremore intenzionale delle dita Scoliosi e contratture nei pazienti in sedia a rotelle
SMA di tipo 3	#253400	Dopo i 18 mesi	Stazione eretta e/o deambulazione autonoma: si	Normale

Tabella 1: Classificazione dell'atrofia muscolare spinale [Munsat TL and  Davies KE. International SMA consortium meeting Neuromuscul Disord. 1992]

Clinica

Il sintomo principale delle SMA è la debolezza muscolare simmetrica del tronco e degli arti, più evidente negli arti inferiori e nella muscolatura prossimale, associata a ipo-areflessia. Il coinvolgimento della muscolatura estrinseca degli occhi, della muscolatura del viso, del diaframma e del miocardio possono essere considerati criteri di esclusione [Munsat et al. 1992]. Nella SMA di tipo I l'atrofia spesso non è evidente, perchè compensata da grasso sottocutaneo. Un criterio di inclusione è la presenza di fascicolazioni e tremore: le fascicolazioni della lingua non sono di frequente osservazione nella SMA di tipo I, ma si riscontrano nel 70% dei pazienti con SMA di tipo II. Nella SMA di tipo III sono presenti fascicolazioni della muscolatura degli arti in circa la metà dei casi. Nelle forme di tipo II e III si osserva frequentemente tremore delle mani. Nella SMA I si possono occasionalmente riscontrare delle importanti limitazioni nei movimenti, in particolare per quanto riguarda l'adduzione dell'anca o l'estensione del ginocchio o del gomito. Alterazioni del sistema nervoso centrale non sono mai presenti, così come alterazioni della sensibilità o coinvolgimento oculare o uditivo. Le analisi biochimiche mostrano un'attività della creatinchinasi (CK) nella norma nella SMA I e II o solo leggermente aumentata nella SMA III: livelli di CK >5 volte più grandi del limite superiore della norma orientano la diagnosi verso una malattia primaria del muscolo (miopatia). In presenza di valori di CK elevati, oppure in assenza di una indagine molecolare che conferma una mutazione nel gene SMN,  e’ consigliabile eseguire una biopsia muscolare,  ed eventualmente un dosaggio dell'esoaminidasi per escludere la possibilità di trovarsi di fronte a un quadro diverso dall'atrofia muscolare spinale.
L'elettromiografia (EMG) mostra denervazione recente e denervazione-reinnervazione ed un ridotto reclutamento dei potenziali d'azione motori. Il tracciato mostra attività spontanea di denervazione, che e’ un elemento suggestivo nella SMA I. Queste caratteristiche sono comuni nella SMA I, meno frequenti nella SMA II e non si osservano nella SMA III [Buchthal & Olsen 1970 , Hausmanowa-Petrusewicz and Karwanska, 1986]. In tutti i pazienti si osservano onde polifasiche, onde positive di grande ampiezza, fibrillazioni e ampiezza e durata dei potenziali di azione motori aumentati. Le velocità di conduzione nervosa sensitive e motorie sono normali. Nelle forme più gravi di SMA I, tuttavia, si può osservare una riduzione delle velocità sensitive e motoria causata dalla perdita di fibre nervose di grandi dimensioni.
La biopsia mostra gruppi di fibre atrofiche di entrambi i tipi (1, 2a e 2b) e fibre ipertrofiche di tipo 1. Se l’analisi molecolare del gene SMN non conferma la mutazione responsabile, allora e’ importante richiedere una seconda biopsia muscolare per tentare di ottenere una diagnosi alternativa. Diagnosi differenziale
L'atrofia muscolare spinale di tipo I (SMA I) quando si manifesta alla nascita si presenta con il quadro clinico del floppy infant. Questa condizione può essere determinata da molte altre patologie, che vanno considerate nella diagnosi differenziale. L'ipotonia, nel neonato come nell'adulto,  può essere di origine centrale, periferica o muscolare. Nell'ipotonia centrale i riflessi osteotendinei sono conservati o accentuati e il segno di Babinski può essere positivo. La causa più frequente è un danno ipossico perinatale, ma se l'ipotonia si associa a facies caratteristica o malformazioni a carico di organi interni, è verosimile che possa trattarsi di una condizione sindromica o di una malattia metabolica.
L'ipotonia periferica, dovuta ad alterazioni del motoneurone, è in genere un sintomo isolato ed i riflessi osteotendinei sono assenti; fascicolazioni della lingua e fini tremori alle mani sono caratteristici della SMA, ma non sempre di facile osservazione. L'atrofia muscolare spino-bulbare X-legata, SBMA o malattia di Kennedy, è dovuta a degenerazione del secondo motoneurone, come la SMA, ma si manifesta più tardivamente, in soggetti maschi, e spesso in associazione ad altri sintomi causati da insensibilità agli androgeni (ginecomastia, atrofia testicolare e infertilità) [La Spada et al, 1991]. La sclerosi laterale amiotrofica (ALS o SLA) si differenzia dalla SMA per il coinvolgimento sia del primo sia del secondo motoneurone, presentando quindi, oltre all'ipotonia e all'iporeflessia, anche sintomi di origine piramidale come l’ipertonia, l’iperreflessia e la spasticità [Rowland et al, 2001].
L'atrofia muscolare spinale distale è una malattia geneticamente eterogenea, si differenzia dalla SMA prossimale per l'interessamento di distretti muscolari diversi:  si manifesta inizialmente con atrofia della muscolatura distale, e solo successivamente possono essere interessati altri distretti [Passamonti L. et al. 2004]. Le ipotonie da malattia primitiva del muscolo, come la distrofia muscolare di Duchenne, inizialmente si manifestano con un ritardo dello sviuppo motorio, in seguito si rendono evidenti per difficoltà nella deambulazione (andatura anserina o steppante), nel salire e scendere le scale o nel rialzarsi da terra. I riflessi osteontedinei sono ridotti o assenti, come nella SMA, ma i livelli di CK sono marcatamente aumentati e generalmente è presente una debolezza della muscolatura facciale che non si osserva nell'atrofia muscolare spinale cronica. Anche nelle forme a insorgenza giovanile o adulta la diagnosi differenziale con la SMA (di tipo II o III) è possibile sulla base dei livelli di CK, dei dati della biopsia muscolare e di quelli dell'elettromiografia che non mostra il quadro tipico da denervazione osservato nella SMA.

           

		Criterio di inclusione	Criterio di esclusione
Debolezza muscolare		Tronco e arti (più evidente agli arti prossimali e agli arti inferiori) Simmetrica	Debolezza dei muscoli estrinseci dell’occhio, del diaframma, del miocardio Marcata debolezza dei muscoli del viso
Caratteristiche associate		Fascicolazioni della lingua in 70% delle SMAII degli arti 50% delle SMAIII Tremore delle mani (SMA II e III)	Alterazioni della sensibilità* Alterazioni del sistema nervoso centrale Artrogriposi Coinvolgimento di altri organi di senso
Creatinchinasi (CK)		Nella norma o leggermente aumentata	CK aumentata >5 volte rispetto ai valori normali superiori
Distrofina ed altre proteine muscolari	(dosaggi da considerare solo se CK ha valori elevati)	Nella norma	Inferiore alla norma
		Nella norma	Inferiore alla norma
Esosaminidasi
Elettromiografia		Attività spontanea anormale	Riduzione della velocità di conduzione nervosa <70% rispetto alla norma* Potenziali sensitivi anomali
Biopsia muscolare		Gruppi di fibre atrofiche di entrambe i tipi Fibre ipertrofiche, in genere di tipo I

• Non si osservano clinicamente deficit delle sensibilità. Tuttavia, una riduzione delle velocità di conduzione motoria e sensitiva può essere osservata in forme gravi di SMA I come effetto dell’importante deplezione delle fibre di grande diametro [Rudnik-Schoneborn et al. Neurology 60: 983-987, 2003].

Tabella 2: Criteri diagnostici per l'atrofia muscolare spinale.

Genetica molecolare

Nel 1990, il locus per tutte le forme di SMA è stato mappato sul cromosoma 5q13, in una regione caratterizzata da una elevata instabilità genomica con sequenze ripetute, pseudogeni, delezioni e duplicazioni invertite [Bussaglia E. et al 1995; Parsons DW et al 1996]. Il gene responsabile della SMA, SMN (Survival Motor Neuron) è presente infatti in due copie altamente omologhe: una telomerica, SMN1, e una centromerica, SMN2 [Lefebvre et al., 1995]. E' stato ormai definitivamente chiarito che la patogenesi della malattia è riconducibile alla perdita in omozigosi  della copia telomerica del gene SMN (SMN1, OMIM #601627), deleto in maniera specifica nel 95% dei soggetti con SMA a prescindere dal fenotipo clinico. Inoltre, in soggetti affetti e non deleti in omozigosi, sono state identificate diverse mutazioni puntiformi nel gene SMN1, a conferma del suo ruolo di gene malattia [Hahnen E. et al 1997; Lefebvre S. et al. 1995, ; Brahe C. et al 1996;]. SMN2 differisce da SMN1 solo per otto nucleotidi, cinque intronici e tre localizzati sugli esoni 7 ed 8 [Burglen L. et al 1996; Lefebvre S. et al 1995]. La differenza critica tra i due geni SMN è il cambiamento di base C®T  in una sequenza exonic splicing enhancer (ESE) che regola l’inclusione dell’esone 7 nei trascritti : la maggior parte dei trascritti di SMN1 contiene infatti i 9 esoni del gene, mentre SMN2 produce per l’80% circa diverse isoforme non funzionali mancanti degli esoni 5 o 7 [Gennarelli M. et al 1995; Feldkotter M. et al 2002] (Fig. 1). La proteina SMN è un polipeptide di 38 kDa espresso in maniera ubiquitaria, in particolare ad elevati livelli nei motoneuroni spinali [Lefebvre et al. 1997; Coovert et al. 1997]. Studi di immuno-citochimica hanno dimostrato che SMN è uno dei costituenti delle “gems”, una nuova classe di organelli sub-nucleari coinvolti nel metabolismo degli RNA messaggeri [Liu and Dreyfuss, 1996].

La delezione in omozigosi del gene SMN2, in presenza di almeno una copia di SMN1, non determina il fenotipo dell'atrofia muscolare spinale ed è presente infatti in circa il 5-10% della popolazione generale. E’ stato tuttavia dimostrato che i pazienti SMA presentano un numero variabile di copie di geni SMN2 (nella maggioranza dei casi 2-4 copie) e che esiste una correlazione inversa, sebbene non assoluta, tra il numero di copie e la gravità fenotipica [Feldkotter et al., 2002]. Il numero di copie di SMN2 non influenza però la variabilità clinica in coppie di fratelli con fenotipo discordante, supportando l'ipotesi della presenza di altri geni che modificano il fenotipo dell'atrofia muscolare spinale [Helmken C. et al, 2003]. 

.
Il gene NAIP (Proteina Inibitrice dell’Apoptosi Neuronale) è presente in più copie nella regione SMA, ma una sola di esse è funzionale : le altre sono pseudogeni, presenti in un numero di copie che varia da individuo a individuo. NAIP è assente in circa la metà dei pazienti SMA, ma la frequenza di delezione è significativamente più elevata nei soggetti affetti dalla forma acuta della malattia [Roy et al, 1995]. Il prodotto proteico di NAIP presenta omologia con la proteina di baculovirus che inibisce l'apoptosi neuronale. Inoltre, diversi esperimenti hanno confermato che NAIP sopprime l’apoptosi nelle cellule dei mammiferi [Liston et al., 1996].
Dalla regione SMA, è stato successivamente isolato un terzo gene duplicato, p44, [Carter et al., 1997]. P44 codifica per una subunità del fattore di trascrizione TFIIH e la sua copia telomerica è deleta in circa il 15% dei pazienti SMA. Il ruolo di questo gene nella patogenesi delle SMA è ancora controverso, e saranno necessari ulteriori studi per chiarire la sua influenza sulle manifestazioni cliniche della malattia.

 

 Test genetico per SMA: strategia generale

• Appropriata selezione su base clinica dei pazienti per l’analisi molecolare.
• Conferma della diagnosi clinica attraverso la rilevazione della delezione in omozigosi degli esoni 7 ed eventualmente 8 del gene SMN1 (screening di I livello).
• Nei casi in cui non è presente la delezione in omozigosi del gene SMN1 vengono richieste ulteriori indagini cliniche, compresa biopsia muscolare, a conferma del sospetto di SMA secondo i criteri riportati in Tabella 2.
• Se il sospetto clinico di SMA persiste si passa ad uno screening di II livello che consiste dapprima nell’analisi della delezione in eterozigosi del gene SMN1 attraverso saggi semiquantitativi. Se un paziente presenta una sola copia del gene SMN1, c’è una probabilità del 95% che sia un eterozigote composto delezione/mutazione per il gene SMN1.
• Ricerca di mutazioni nel gene SMN1. In presenza di un fenotipo caratteristico, se ci si trova di fronte ad una variante non descritta in letteratura, una volta esclusa la possibilità di un polimorfismo (testando 200 cromosomi di controllo) si può ragionevolmente ritenere che si tratti di una mutazione patogenetica.
• Test di identificazione dei portatori sani della delezione del gene SMN1 da effettuare mediante dosaggio semiquantitativo oppure analisi di linkage nei consanguinei del probando con delezione in omozigosi del gene SMN1.
• Test di identificazione dei portatori sani della delezione del gene SMN1 nei partners di soggetti eterozigoti certi o tali dopo dosaggio semiquantitativo; Valutazione del rischio riproduttivo per SMA.
• Diagnosi prenatale attraverso l’analisi della delezione e/o mutazione del gene SMN1 (test diretto) in combinazione con analisi di linkage utilizzando marcatori microsatelliti della regione cromosomica 5q13. L’esclusione di contaminazioni di cellule materne nei tessuti fetali che si analizzano (villi coriali o amniociti) è obbligatoria.

 

 

 

 

 

 

 

Indicazioni al test genetico per SMA

Conferma della diagnosi clinica
Considerazioni generali
La diagnosi di SMA si basa sull'evidenza clinica, dei test di laboratorio e strumentali, e sulla conferma diagnostica molecolare.  Il test molecolare per confermare dal punto di vista genetico una diagnosi clinica di SMA si basa sulla rilevazione dell’assenza in omozigosi del gene SMN1, osservata nel 95% circa dei pazienti .La perdita del gene SMN1 avviene nella maggior parte dei casi per delezione (generalmente eventi che coinvolgono l’intero gene) oppure per fenomeni di conversione genica SMN1-SMN2. I protocolli molecolari descritti in letteratura e riportati di seguito si basano sull’analisi delle sostituzioni nucleotidiche negli esoni 7 ed 8, che consentono di distinguere il gene SMN1 dal gene SMN2. Si tratta di metodiche che appartengono alla routine del laboratorio di biologia molecolare e vengono considerate come screening di primo livello. La presenza della delezione  in omozigosi dell’esone 7 del gene SMN1 in un soggetto con sintomi clinici ha infatti una specificità diagnostica superiore al 99%. L’assenza di tale delezione allo stato omozigote tuttavia non esclude una diagnosi di SMA poiché circa il 2-5% dei pazienti sono eterozigoti composti per la delezione/mutazione del gene SMN1 (solo in rarissimi casi è stata descritta una mutazione allo stato omozigote). Se non si rileva la delezione in omozigosi del gene SMN1, è necessario richiedere un approfondimento clinico a supporto del sospetto di SMA prima di procedere ad uno screening più laborioso di secondo  livello, che deve essere eseguito in laboratori specializzati. Questo consiste dapprima nella determinazione del numero di copie del gene SMN1 attraverso saggi semiquantitivi. La presenza della delezione in eterozigosi del gene SMN1 in soggetti sintomatici, supporta fortemente la diagnosi clinica di SMA. Va considerato inoltre che, virtualmente, tutti i pazienti con SMA associata al locus 5q13 sono portatori della delezione in forma omozigote (94%) o eterozigote. In ogni caso la conferma del sospetto clinico si ha solo dopo aver identificato anche la mutazione puntiforme nell’allele non deleto del gene SMN1. Occorre sottolineare che lo screening di mutazioni del gene SMN1 è un’indagine complessa che deve tenere conto della presenza di un numero variabile di copie del gene SMN2, le cui sequenze possono mascherare eventuali varianti patologiche. Ad oggi sono state descritte più di 20 mutazioni del gene SMN1 che, in associazione con la delezione del gene in eterozigosi, determinano il fenotipo SMA Ogino S, Wilson RB, 2004; Sun Y et al 2005]. Le più frequenti mutazioni intrageniche descritte sono la mutazione missenso Y272C (815A>G) e le mutazioni frameshift 768_778dupTGCTGATGCTT e 399_402delAGAG [Ogino S, Wilson RB, 2004; Wirth B, 2000].
Il sottotipo clinico della SMA sembra essere in parte determinato dalla natura della mutazione del gene SMN1. In generale la SMA I è associata con la delezione in entrambi gli alleli, la SMAII con la delezione di SMN1 su un allele e la conversione genica di SMN1 in SMN2 sull’altro, mentre la SMA III con una conversione genica SMN1->SMN2 in tutti e due gli alleli oppure dall’associazione delezione/mutazione. La rilevazione dell’assenza in omozigosi dell’esone 7 assieme alla presenza dell’esone 8 del gene SMN1 è indicativa di una conversione genica SMN1/SMN2, osservato in circa l’ 8% dei soggetti con SMA. In ogni caso la mancanza dell’esone 7 del gene SMN1 è sufficiente per causare una ridotta espressione della proteina SMN e la conseguente insorgenza del fenotipo clinico. Almeno uno dei fattori che spiegano il fenotipo variabile della SMA è il numero di copie del gene SMN2 [Vitali et al., 1999; Wirth B. et al, 2006; Harada Y et al 2002; Cusco I et al 2006; Monani UR  et al 2002] . Soggetti con SMA III hanno in media, un numero di copie di SMN2 superiore rispetto agli individui con SMA I e II, e questo è correlato con una espressione maggiore di trascritto “full length” del gene SMN. Tuttavia, l’osservazione di fenotipi discordanti in fratelli aploidentici al locus SMA, non permette tuttavia di attribuire a questo parametro genetico un chiaro ed inequivocabile valore prognostico. Geni modificatori aggiuntivi a SMN2 potrebbero avere un ruolo determinante nell’evoluzione del decorso clinico della SMA, non è quindi consigliabile fornire questo tipo di informazione alla famiglia del probando.

Protocolli molecolari

Analisi della delezione in omozigosi del gene SMN1
La delezione in omozigosi degli esoni 7 ed 8 del gene SMN1 può essere rilevata attraverso i seguenti metodi:

• Analisi PCR/RFLP. Per distinguere l'esone 7 dei geni SMN1/SMN2 possono essere usati indifferentemente gli enzimi DraI o HinfI dopo amplificazione con primer specifici [van der Steege et al., 1995; Xu R et ql 2003; Ogino S, Wilson RB.2004], per l'esone 8 viene utilizzato l'enzima DdeI. L'enzima di restrizione DraI digerisce solo l'esone 7 del gene SMN2, poichè nella reazione di PCR viene utilizzato un primer reverse con un mismatch che genera un sito di riconoscimento per questo enzima quando si lega alla copia centromerica del gene SMN. Nel caso della digestione con enzima Hinf I, siti di restrizione interni vengono generati per entrambi i prodotti di PCR relativi ai geni SMN1/SMN2 per monitorare la completezza della reazione di digestione. Si tratta di un test semplice e relativamente rapido con un'elevata specificità diagnostica.

 

• SSCP su gel di poliacrilammide. L'analisi di SSCP ha il vantaggio di rilevare sia le delezioni del gene SMN1 che eventuali mutazioni puntiformi a carico del'esone 7 del gene. Un potenziale svantaggio è che il metodo non permette di distinguere i polimorfismi ed in letteratura ne è stato descritto uno relativamente frequente (4% dei membri familiari asintomatici) che risulta in un pattern di migrazione simile a quella della delezione in omozigosi [Wang CH et al 1996]. Questo metodo è stato perciò quasi completamente sostituito dal metodo PCR/RFLP.

• DHPLC. L’analisi del prodotto di amplificazione dell’esone 7 del gene SMN attraverso cromatografia liquida denaturante ad alta pressione permette di distinguere chiaramente tre picchi di eluizione corrispondenti agli omoduplici dei geni SMN1, SMN2 ed agli eteroduplici SMN1/SMN2. La comparazione del cromatogramma relativo al soggetto in esame con opportuni soggetti di controllo con 1 o 0 copie del gene SMN1, permette di rilevare la presenza di una delezione in omozigosi del gene SMN1 [Sutomo R. et al 2002; Mazzei R. et al, 2003]. Come nella metodica precedente, il limite è costituito dalla presenza di polimorfismi all’interno della regione amplificata che potrebbero risultare in un profilo di eluizione ambiguo del campione da testare.

 

I metodi fin qui descritti non permettono di identificare in maniera chiara i fenomeni di conversione genica, per i quali esistono test specifici [Hahnen et al 1996; Cusco I, et al 2001]. Il metodo PCR/RFLP non discrimina tra un fenomeno di delezione ed uno di conversione genica, tuttavia determina in maniera affidabile l'assenza dell'esone 7 ed 8 del gene SMN1 dalla loro posizione genomica corretta. Il test per la delezione dell'esone 7 è di per sé sufficiente per determinare l'assenza del gene SMN1, tuttavia è raccomandabile accompagnare questa analisi con un secondo test indipendente che è quello relativo all'esone 8 a conferma del risultato ottenuto. L'analisi del solo esone 8 può invece portare a risultati falsamente negativi poiché questo esone risulta non deleto in circa l’ 8% dei soggetti con SMA associata a delezione dell'esone 7 [Ogino S, Wilson RB.2004]. E' opportuno inserire nella reazione di restrizione un controllo positivo ed un controllo con almeno una copia del gene SMN1 per monitorare l'avvenuta reazione enzimatica, che è critica in questo protocollo molecolare. La reazione di PCR deve invece includere un campione in cui non viene aggiunto templato come controllo negativo per escludere eventuali contaminazioni da DNA esterno.

Screening di mutazioni del gene SMN1

Sono stati descritti diversi metodi per la caratterizzazione di mutazioni puntiformi del gene SMN1 [Ogino S, Wilson RB. 2002; Ogino S, Wilson RB. 2004] L’unico metodo che consente di determinare in maniera inequivocabile se la mutazione individuata si trovi su SMN1 o su SMN2, consiste nel sequenziamento  dei trascritti corrispondenti ai due geni in reazioni separate. Il protocollo prevede l’estrazione di RNA, la sua restrotrascrizione in cDNA, la co-amplificazione dei trascritti SMN1/SMN2 e la loro separazione attraverso clonaggio in batteri. Dopo aver selezionato i cloni SMN1-specifici, viene amplificata la sequenza del cDNA e analizzata attraverso sequenziamento diretto [Sun Y et al.,2005]. Questo metodo, sebbene laborioso, ha il vantaggio di analizzare selettivamente la regione codificante del gene SMN1, evitando che sequenze del gene SMN2 possano mascherare eventuali varianti nucletodiche. Nel caso di mutazioni non descritte in letteratura, si può procedere ad analisi funzionali più approfondite come la valutazione del livello e della localizzazione della proteina SMN. Questo complesso screening di II livello deve essere eseguito in centri qualificati, con una documentata esperienza nel campo della diagnostica molecolare della SMA. Si raccomanda di procedere a questa analisi solo dopo aver richiesto ulteriore indagini cliniche (compresa la biopsia muscolare) sul probando ed aver accertato lo stato di eterozigosi per il gene SMN1.

Identificazione dei soggetti eterozigoti per la delezione di SMN1

Considerazioni generali

Il test di identificazione degli eterozigoti viene utilizzato nelle seguenti situazioni:

• In pazienti con sospetta SMA in assenza della delezione in omozigosi del gene SMN1. Se la malattia è associata al locus 5q13 la delezione di SMN1 deve trovarsi infatti almeno nello stato di eterozigosi (ad eccezione dei casi di dimostrata consanguineità dei genitori del probando). L’individuazione di soggetti di questo tipo implica un’alta probabilità di trovare una mutazione puntiforme nell’altro cromosoma.
• In genitori di pazienti deceduti per sospetta SMA non confermata con analisi molecolare.
• Parenti di primo o secondo grado di genitori di pazienti SMA.
• Partners di portatori sani accertati

 

 Una problematica  relativa a questo test è l'esistenza di portatori con due copie di SMN1 sullo stesso cromosoma e l’assenza di SMN1 sull'altro cromosoma 5 (cosiddetti 0,2 circa il 4% dei portatori. [McAndrew PE et al, 1997, Feldkotter M et al 2002, Wirth et al., 1999]. Ciò comporta una perdita di sensibilità del test dal momento che individui con un genotipo [1,1] per SMN1 (non-portatori) non sono distinguibili da soggetti con genotipo [0,2] che hanno le due copie di SMN1 sullo stesso cromosoma (portatori).
Bisogna inoltre considerare la frequenza delle mutazioni intrageniche del gene SMN1 (circa 3-5% degli alleli mutati) che sfuggono all’analisi quantitativa dell’esone 7 di SMN1 e riducono ulteriormente la sensibilità della metodica che non può essere superiore al 93-94%.
Dal punto di vista sperimentale , la situazione è ulteriormente complicata dall’elevata omologia di sequenza tra i geni SMN1-SMN2, che rende assai difficile l’amplificazione specifica mediante PCR dell’uno o dell’altro gene. Inoltre, SMN2 è presente in un numero variabile di copie compreso tra 0 e 4 e quindi il numero il gene SMN1 non può essere dosato in maniera accurata relativamente alla sua copia centromerica (ad esempio, se il rapporto SMN1/SMN2 è uguale a 1 potrebbe indicare un genotipo 1T/1C ma anche 2T/2C). Quindi oltre che calcolare il rapporto SMN1/SMN2, è necessario conoscere il numero totale di copie dei geni SMN rispetto a geni di controlli al di fuori del locus SMA.  L’analisi di segregazione di marcatori polimorfici al locus 5q13, permette la valutazione dello stato di portatore sano di SMA se non è possibile effettuare il saggio semiquantitivo diretto. Sono disponibili oggi numerosi marcatori molecolari intragenici ed extragenici che consentono con correttezza di stabilire le fasi degli aplotipi a rischio  con una probabilità superiore al 99% [Scheffer H et al 2001].

Protocolli molecolari
Sono stati descritti diversi metodi per l'identificazione molecolare di soggetti portatori sani di SMA, basati su protocolli di PCR semiquantitativa in cui il gene SMN viene comparato ad uno o più geni di controllo presenti in duplice copia nel genoma. Ne riportiamo di seguito solo alcuni:

PCR quantitativa. [McAndrew PE et al, 1997]. Il metodo si basa su PCR-RFLP competitiva dove il gene CFTR (esone 4), presente in duplice copia nel genoma umano, rappresenta il gene di riferimento. Per correggere le eventuali variazioni nell’efficienza di amplificazione, il saggio prevede l’inclusione di standard interni sia del gene SMN che del gene CFTR. Ogni standard interno presenta gli stessi siti di legame per i primers della corrispondente sequenza genomica e inoltre porta al suo interno una piccola delezione che consente la separazione e la quantificazione dei prodotti di PCR rispettivamente degli standards e del DNA genomico. Il numero di copie di SMN1 è determinato dalla co-amplificazione di SMN1, di SMN2 e dello standard interno SMN, di CFTR e del suo standard; la digestione enzimatica con DraI taglia selettivamente la copia SMN2.
Scheffer H. [2000] ha migliorato tale metodica apportando alcune modifiche : 1) sostituzione del gene di riferimento CFTR con un gene RB (esone 13) contenente un sito di restrizione DraI consentendo di monitorare la completa digestione enzimatica; 2) aggiunta di una terminazione fluorescente ad un primer di ciascun amplicone, permettendo così l’utilizzo di un sequenziatore automatico per la separazione dei frammenti e la loro quantificazione.
Tuttavia il metodi quantitativi sopra descritti mostrano una sovrapposizione dei risultati relativi a soggetti con una e due copie di SMN1; è stato infatti dimostrato che nel 6% dei casi non è possibile escludere lo stato di portatore [Wirth et al., 1999].

PCR competitiva con primer extension. Il saggio messo a punto da Gèrard B. [2000] permette di determinare il rapporto fra i geni SMN (RT/C) tramite allungamento dei primers (minisequencing); la quantità totale di SMN presente nel genoma viene stabilita utilizzando PBGD (porphobilinogen deaminase) come gene di controllo. I controlli interni per SMN e PBGD portano una delezione o inserzione e quindi la separazione dei prodotti di PCR avviene direttamente tramite sequenziatore automatico senza l’utilizzo di enzimi di restrizione. Il limite di questo test è rappresentato dai risultati border-line che possono indurre ad inesatte interpretazioni.

DHPLC. Di recente è stato descritto un metodo innovativo, rapido, sensibile e specifico per l’individuazione di variazioni del DNA che si basa su DHPLC [Sun Y. et al., 2005]. Il test consente il dosaggio di SMN1/SMN2 tramite la combinazione dell’analisi degli eteroduplex e di una PCR multiplex.

 Real-time PCR. Il test descritto da Feldkötter [2002] si basa  su real-time PCR, è rapido e affidabile, in grado di discriminare tra SMN1 e SMN2 e di quantificare il prodotto di PCR nel corso della reazione attraverso l’uso del SYBR Green I. Per distinguere SMN1 da SMN2 vengono utilizzati primers che terminano vicino o proprio a livello dei nucleotidi che differenziano SMN1 da SMN2 (esone 7, posizione 6 e introne 7, posizione +214). Tuttavia un approccio quantitativo senza l’uso di un controllo interno o esterno richiede l’utilizzo di uno stesso metodo di estrazione e quantificazione del DNA, che è spesso un problema quando il DNA proviene da un laboratorio diverso da quello che effettua il test. Anhuf [2003] ha cercato di risolvere, almeno in parte, alcuni di questi problemi: per prima cosa si è passati all’uso di sonde MGB che hanno una più alta temperatura di melting e sono quindi più sensibili al mismatch di una singola base. Il saggio prevede l’amplificazione anche di un locus di riferimento con un numero noto di copie; tale gene dovrebbe risolvere il problema di eventuali deviazioni dovute alla concentrazione del DNA e alla diversa efficienza di amplificazione. I vantaggi sono numerosi e tra questi la capacità di analizzare contemporaneamente un elevato numero di campioni.
Anche se oggi il test basato su QRT-PCR è quello più utilizzato, si raccomanda di validare la sensibilità del dosaggio quantitativo prima di utilizzarlo di routine. E' critica la qualità e la purezza del DNA estratto (si consigliano metodi come il salting out che preservano il DNA integro). Il dosaggio dei campioni deve essere molto accurato e ciascuno di essi deve essere diluito in maniera seriale per disciogliere eventuali impurità. Ogni reazione inoltre, deve essere ripetuta almeno in triplicato per annullare eventuali errori dell’operatore. Tuttavia l’uso di probes fluorescenti e il loro costo elevato rappresentano uno svantaggio insito nella metodica stessa.

Multiplex Ligation-Probe Dependent Amplification (MLPA) [Scarciolla O. et al., 2006]. L’analisi MLPA permette di stabilire in modo accurato il numero di copie di SMN1 e quindi di individuare soggetti portatori-sani della malattia. Il metodo si basa sull’amplificazione contemporanea di 37 differenti tratti genici di cui 16 interni alla regione critica SMA e 21 esterni che mappano su altri autonomi. I prodotti di PCR sono fatti correre su ABI PRISM 310 e analizzati usando il software Gene Mapper 3.5. L’area relativa di ciascun picco viene quindi rapportata ai picchi corrispondenti ai geni di controllo e, contemporaneamente, i campioni da testare vengono messi a confronto con dei campioni a genotipo noto attraverso il software Coffalyzer 2 (MRC-Holland). Il metodo consente di estendere lo studio della delezione all’intera regione SMA. L’analisi MLPA è caratterizzata da un’alta riproducibilità, semplicità di esecuzione e basso costo. Tra gli svantaggi bisogna sottolineare l’incapacità del metodo nell’individuare mutazioni puntiformi del gene SMN1 e l’impossibilità di evidenziare la presenza di due copie si SMN1 sullo stesso allele.

 

Linkage

Il tradizionale metodo di analisi familiare basato sulla segregazione è certamente da preferire quando possibile. La disponibilità di marcatori polimorfi ad elevata informatività rendono praticamente sempre applicabile questo metodo  quando naturalmente si dispone di più componenti del nucleo familiare, probando compreso.

 

Diagnosi prenatale

Considerazioni generali
La diagnosi prenatale di SMA va effettuata solo nelle coppie con accertata familiarità per SMA, documentata dalla presenza nella famiglia di almeno un soggetto affetto confermato e caratterizzato dal punto di vista molecolare. Per quanto riguarda le coppie che hanno già avuto un figlio affetto da SMA, il rischio di ricorrenza è di 25 %, e viene consigliato il monitoraggio della gravidanza alla X-XII settimana mediante villocentesi. Quando il rischio è inferiore, per esempio per una gravidanza di una coppia di cui uno dei due è fratello di un affetto, quindi con un rischio di circa 1/300, viene proposta l'analisi su liquido amniotico che presenta minori rischi relativi al prelievo (circa 0.5%).
In ogni caso è indispensabile che a ciascuna coppia che richiede DP sia fornita una adeguata consulenza genetica nella quale vengano fornite in maniera semplice le seguenti informazioni: valutazione del rischio riproduttivo per SMA, attendibilità e limiti del test molecolare, tempi, modalità e rischi relativi al prelievo di villi coriali  e di liquido amniotico [Linee Guida Ministero della Salute Test Genetici]. Qualora la coppia decida di sottoporsi a DP per SMA è necessario un consenso informato scritto che deve essere discusso con personale qualificato e con adeguato anticipo rispetto alla data fissata per il prelievo. Nel consenso va anche specificato il rischio di contaminazione materna dei tessuti fetali che può portare all’impossibilità di giungere ad un risultato molecolare certo.
La diagnosi molecolare prenatale è effettuata principalmente attraverso il test della delezione in omozigosi del gene SMN1. Si sottolinea che il requisito fondamentale è l’identificazione di questo difetto genetico nel caso indice della famiglia. In letteratura sono stati descritti rari casi di fratelli asintomatici aploidentici a pazienti SMA deleti in omozigosi. Tuttavia, questa condizione è stata riscontrata soltanto in famiglie con SMA di tipo II o III. E’ difficile in questi casi predire il potenziale patogenetico di questi alleli deleti se trasmessi al feto. L’analisi indiretta di segregazione dei marcatori microsatelliti della regione 5q13 è indispensabile nelle famiglie con un paziente clinicamente affetto da SMA che presenti la delezione del gene SMN1 in eterozigosi. Un’eccezione può essere costituita dai casi di un probando nella famiglia con un forte sospetto clinico di SMA e consanguineità dei genitori, questi due fattori infatti rendono più probabile lo stato di omozigosi per un allele raro non deleto per SMN1. L’analisi di linkage con marcatori intragenici e/o fiancheggianti SMN1, è tuttavia raccomandata SEMPRE per confermare il risultato del test diretto di delezione e per escludere contaminazioni di cellule materne nel tessuto fetale. Lo studio di segregazione degli aplotipi a rischio nel nucleo familiare permette anche in alcuni  casi di determinare l’eventuale stato di portatore del feto. E’ opportuno tuttavia che le famiglie alle quali viene somministrato un test prenatale di SMA, ricevano una consulenza genetica pre- e post-test [si veda Linee Guida per le Attività di Genetica Medica, 2004].

Protocolli molecolari

Test diretto attraverso l’analisi della delezione in omozigosi del gene SMN1
Il test viene eseguito come nel caso di conferma diagnostica del sospetto clinico di SMA (vedi apposita sezione). Consigliamo di inserire come controllo positivo per la delezione di SMN1, il caso indice della famiglia in analisi, per confermarne il difetto molecolare (ad es. delezione del solo esone 7 del gene SMN1).

Test diretto attraverso l’analisi di segregazione dei cromosomi a rischio nella famiglia (analisi di linkage)
E' possibile utilizzare una vasta gamma di marcatori microsatelliti fiancheggianti il gene SMN riportati in tabella (Tabella 3). Questo permette nella maggior parte dei casi di trovare almeno un marcatore informativo centromerico ed uno  telomerico per ottenere una probabilità di errore dovuta a ricombinazione inferiore all'1%. Esistono inoltre due marcatori multicopia intragenici localizzati nel promotore dei geni SMN1/SMN2 che possono essere utilizzati in combinazione con l'analisi di marcatori extragenici, in quanto la loro corretta interpretazione è resa difficile dall'elevato numero di alleli presenti. L’utilizzo della elettroforesi capillare per questo tipo di analisi con l’accorgimento di scegliere marcatori microsatelliti di diversa grandezza amplificati attraverso primer marcati con fluorofori distinti, permette di effettuare la lettura in maniera rapida ed affidabile [Botta et al 2005].
La comparazione dei cromatogrammi relativi al DNA fetale e a quello materno permette di escludere eventuali contaminazioni materno-fetali.

Markers della regione di SMN1 (5q11.2-q13.3)
Locus	Localizzazione Rispetto ad SMN	% di Ricombinazione	PIC	Dimensione
D5S679	Prossimale	3	0.63	180-222
D5S680	Prossimale	3	0.57	141-173
D5S125	Prossimale	2	0.38	143 e 147
D5S681	Prossimale	2	0.68	142-156
D5S435	Prossimale	1	0.68	128-144
D5S629	Prossimale	1	0.81	233-253
D5S823	Prossimale	1	0.54	128-150
D5S1556/D5F150	Intragenico/SMN1 promoter region	0	0.98	90-122
D5S149	Intragenico/SMN1 promoter region	0	0.99	166-203
D5S557	Distale	1	0.46	148-172
D5S610	Distale	1	0.80	106-124
D5S351	Distale	1	0.74	196-234
5’-MAP1B	Distale	1	0.76	100
3’MAP1B	Distale	1	0.72	212-226
D5S112	Distale	1	0.74	94-120
D5S127	Distale	3	0.84	96-114
D5S539	Distale	5	0.74	212-220

Tabella 3. Marcatori microsatelliti dalla regione SMA (5q11.2-q13.3). [da Scheffer H et al 2001].

Elenco Siti internet consultabili

http://www.famigliesma.org/chi.htm
http://www.fsma.org/
http://www.genetests.org/

Elenco centri di riferimento per la diagnosi molecolare della SMA

Cattedra di Genetica Medica
Università di Roma “Tor Vergata”
Via Montpellier, 1- 00133 Roma
Prof. Giuseppe Novelli
Dott.ssa Annalisa Botta

Istituto di Genetica Medica
Università Cattolica del S. Cuore
Largo F. Vito, 1 -  00168 Roma
Prof. Christina Brahe
Dr. Francesco Danilo Tiziano

Fondazione IRCCS Istituto Neurologico “Carlo Besta”
Via Celoria, 11- 20133 Milano
Prof. Franco Taroni
Dott.ssa Cinzia Gellera

Bibliografia

• Anhuf D, Eggermann T, Rudnik-Schoneborn S, Zerres K. Determination of SMN1 and SMN2 copy number using TaqMan technology. Hum Mutat. 2003 Jul;22(1):74-8.
• Botta A, Tacconelli A, Bagni I, Giardina E, Bonifazi E, Pietropolli A, Clementi M, Novelli G. Transmission ratio distortion in the spinal muscular atrophy locus: data from 314 prenatal tests. Neurology. 2005 Nov 22;65(10):1631-5.
• Brahe C, Clermont O, Zappata S, Tiziano F, Melki J, Neri G. Frameshift mutation in the survival motor neuron gene in a severe case of SMA type I. Hum Mol Genet 1996;5:1971-1976
• Brahe C, Servidei S, Zappata S, Ricci E, Tonali P, Neri G. Genetic homogeneity between childhood-onset and adult-onset autosomal recessive spinal muscular atrophy.
  Lancet. 1995 Sep 16;346(8977):741-2.
• Buchthal F, Olsen PZ.  Electromyography and muscle biopsy in infantile spinal muscular atrophy. Brain. 1970;93(1):15-30
• Burd L, Short SK, Martsolf JT, Nelson RA. Prevalence of type I spinal muscular atrophy in North Dakota. Am J Med Genet. 1991 Nov 1;41(2):212-5.
• Burglen L, Lefebvre S, Clermont O, et al. Structure and organization of the human survival motor neurone (SMN) gene. Genomics 1996;32:479-482
• Bussaglia E, Clermont O, Tizzano E, et al. A frame-shift deletion in the survival motor neuron gene in Spanish spinal muscular atrophy patients. Nat Genet 1995;11:335-337
• Campbell L, Potter A, Ignatius J, Dubowitz V, Davies K. Genomic variation and gene conversion in spinal muscular atrophy: implications for disease process and clinical phenotype. Am J Hum Genet 1997;61:40-50
• Carter TA, Bonnemann CG, Wang CH, Obici S, Parano E, De Fatima Bonaldo M, Ross BM, Penchaszadeh GK, Mackenzie A, Soares MB, Kunkel LM, Gilliam TC. A multicopy transcription-repair gene, BTF2p44, maps to the SMA region and demonstrates SMA associated deletions. Hum Mol Genet. 1997 Feb;6(2):229-36.
• Coovert DD, Le TT, McAndrew PE, Strasswimmer J, Crawford TO, Mendell JR, Coulson SE, Androphy EJ, Prior TW, Burghes AH. The survival motor neuron protein in spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 1997 Aug;6(8):1205-14.
• Cusco I, Barcelo MJ, del Rio E, Martin Y, Hernandez-Chico C, Bussaglia E, Baiget M, Tizzano EF. Characterisation of SMN hybrid genes in Spanish SMA patients: de novo, homozygous and compound heterozygous cases. Hum Genet. 2001 Mar;108(3):222-9.
• Cusco I, Cusco IBarcelo MJ, Rojas-Garcia R, Illa I, Gamez J, Cervera C, Pou A, Izquierdo G, Baiget M, Tizzano EF. SMN2 copy number predicts acute or chronic spinal muscular atrophy but does not account for intrafamilial variability in siblings. J Neurol. 2006 Jan;253(1):21-5. Epub 2005 Jun 28
• Czeizel A. High incidence of acute infantile spinal atrophy in Hungary. Hum Genet. 1991 Mar;86(5):539. 
• Dubowitz V. Chaos in the classification of SMA: a possible resolution. Neuromuscul Disord. 1995 Jan;5(1):3-5
• Feldkotter M, Schwarzer V, Wirth R, Wienker TF, Wirth B. Quantitative analyses of SMN1 and SMN2 based on real-time lightCycler PCR: fast and highly reliable carrier testing and prediction of severity of spinal muscular atrophy. Am J Hum Genet. 2002 Feb;70(2):358-68
• Gennarelli M, Lucarelli M, Capon F, et al. Survival motor neuron gene transcript analysis in muscles from spinal muscular atrophy patients. Biochem Biophys Res Commun 1995;213:342-348
• Gerard B, Ginet N, Matthijs G, Evrard P, Baumann C, Da Silva F, Gerard-Blanluet M, Mayer M, Grandchamp B, Elion J. Genotype determination at the survival motor neuron locus in a normal population and SMA carriers using competitive PCR and primer extension. Hum Mutat. 2000 Sep;16(3):253-63.
• Hahnen E, Schonling J, Rudnik-Schoneborn S, Raschke H, Zerres K, Wirth B. Missense mutations in exon 6 of the survival motor neuron gene in patients with spinal muscular atrophy (SMA). Hum Mol Genet 1997;6:821-825

Hahnen E, Schonling J, Rudnik-Schoneborn S, Zerres K, Wirth B. Hybrid survival motor neuron genes in patients with autosomal recessive spinal muscular atrophy: new insights into molecular mechanisms responsible for the disease. Am J Hum Genet. 1996 Nov;59(5):1057-65.

• Harada Y, Sutomo R, Sadewa AH, Akutsu T, Takeshima Y, Wada H, Matsuo M, Nishio H. Correlation between SMN2 copy number and clinical phenotype of spinal muscular atrophy: three SMN2 copies fail to rescue some patients from the disease severity. J Neurol. 2002 Sep;249(9):1211-9.
• Hausmanowa-Petrusewicz I, Karwanska A. Electromyographic findings in different forms of infantile and juvenile proximal spinal muscular atrophy. Muscle Nerve. 1986 Jan;9(1):37-46.

Helmken C, Hofmann Y, Schoenen F, Oprea G, Raschke H, Rudnik-Schoneborn S, Zerres K, Wirth B. Evidence for a modifying pathway in SMA discordant families: reduced SMN level decreases the amount of its interacting partners and Htra2-beta1. Hum Genet. 2003 Dec;114(1):11-21 

• La Spada AR, Wilson EM, Lubahn DB, Harding AE, Fischbeck KH. Androgen receptor gene mutations in X-linked spinal and bulbar muscular atrophy. Nature. 1991 Jul 4;352(6330):77-9.
• Lefebvre S, Burglen L, Reboullet S, et al. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell 1995;80:155-165
• Lefebvre S, Burlet P, Liu Q, Bertrandy S, Clermont O, Munnich A, Dreyfuss G, Melki J. Correlation between severity and SMN protein level in spinal muscular atrophy. Nat Genet. 1997 Jul;16(3):265-9.
• Liston P, Roy N, Tamai K, Lefebvre C, Baird S, Cherton-Horvat G, Farahani R, McLean M, Ikeda JE, MacKenzie A, Korneluk RG.  Suppression of apoptosis in mammalian cells by NAIP and a related family of IAP genes. Nature. 1996 Jan 25;379(6563):349-53.
• Liu Q, Dreyfuss G. A novel nuclear structure containing the survival of motor neurons protein. EMBO J. 1996 Jul 15;15(14):3555-65.
• Mazzei R, Conforti FL, Muglia M, Sprovieri T, Patitucci A, Magariello A, Gabriele AL, Quattrone A. A simple method for diagnosis of autosomal recessive spinal muscular atrophy by denaturing high-performance liquid chromatography. J Child Neurol. 2003 Apr;18(4):269-71.
• McAndrew PE, Parsons DW, Simard LR, Rochette C, Ray PN, Mendell JR, Prior TW, Burghes AH. Identification of proximal spinal muscular atrophy carriers and patients by analysis of SMNT and SMNC gene copy number. Am J Hum Genet. 1997 Jun;60(6):1411-22.
• Melki J, Lefebvre S, Burglen L, Burlet P, Clermont O, Millasseau P, Reboullet S, Benichou B, Zeviani M, Le Paslier D, et al. De novo and inherited deletions of the 5q13 region in spinal muscular atrophies. Science. 1994 Jun 3;264(5164):1474-7.
• Monani UR, Sendtner M, Coovert DD, Parsons DW, Andreassi C, Le TT, Jablonka S, Schrank B, Rossol W, Prior TW, Morris GE, Burghes AH. The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 2000 Feb 12;9(3):333-9.
• Munsat TL, Davies KE. International SMA consortium meeting. (26-28 June 1992, Bonn, Germany). Neuromuscul Disord. 1992;2(5-6):423-8.
• Ogino S, Wilson RB. Genetic testing and risk assessment for spinal muscular atrophy (SMA). Hum Genet. 2002 Dec;111(6):477-500. Epub 2002 Oct 3. Review.
• Ogino S, Wilson RB. Spinal muscular atrophy: molecular genetics and diagnostics.
  Expert Rev Mol Diagn. 2004 Jan;4(1):15-29. Review.
• Parsons DW, McAndrew PE, Monani UR, Mendell JR, Burghes AH, Prior TW. An 11 base pair duplication in exon 6 of the SMN gene produces a type I spinal muscular atrophy (SMA) phenotype: further evidence for SMN as the primary SMA-determining gene. Hum Mol Genet 1996;5:1727-1732
• Passamonti L, Muglia M, Magariello A, Bellesi M, Conforti FL, Mazzei R, Patitucci A, Gabriele AL, Sprovieri T, Peluso G, Caracciolo M, Medici E, Logullo F, Provinciali L, Quattrone A. Further evidence of genetic heterogeneity in autosomal dominant distal motor neuronopathy. Neuromuscul Disord. 2004 Nov;14(11):705-10. 
• Pearn J.  Incidence, prevalence, and gene frequency studies of chronic childhood spinal muscular atrophy. J Med Genet. 1978 Dec;15(6):409-13.
• Pearn J. Classification of spinal muscular atrophies.Lancet. 1980 Apr 26;1(8174):919-22.
• Pearn JH.  The gene frequency of acute Werdnig-Hoffmann disease (SMA type 1). A total population survey in North-East England. J Med Genet. 1973 Sep;10(3):260-5.
• Rowland, L. P.; Shneider, N. A. Amyotrophic lateral sclerosis. New Eng. J. Med. 344: 1688-1700, 2001.
• Roy N, Mahadevan MS, McLean M, Shutler G, Yaraghi Z, Farahani R, Baird S, Besner-Johnston A, Lefebvre C, Kang X, et al.  The gene for neuronal apoptosis inhibitory protein is partially deleted in individuals with spinal muscular atrophy. Cell. 1995 Jan 13;80(1):167-78.
• Rudnik-Schoneborn S, Goebel HH, Schlote W, Molaian S, Omran H, Ketelsen U, Korinthenberg R, Wenzel D, Lauffer H, Kreiss-Nachtsheim M, Wirth B, Zerres K. Classical infantile spinal muscular atrophy with SMN deficiency causes sensory neuronopathy. Neurology. 2003 Mar 25;60(6):983-7.
• Scarciolla O, Stuppia L, De Angelis MV, Murru S, Palka C, Giuliani R, Pace M, Di Muzio A, Torrente I, Morella A, Grammatico P, Giacanelli M, Rosatelli MC, Uncini A, Dallapiccola B. Spinal muscular atrophy genotyping by gene dosage using multiple ligation-dependent probe amplification. Neurogenetics. 2006 Jul 22; [Epub ahead of print].
• Scheffer H, Cobben JM, Matthijs G, Wirth B. Best practice guidelines for molecular analysis in spinal muscular atrophy. Eur J Hum Genet. 2001 Jul;9(7):484-91. Review.
• Scheffer H, Cobben JM, Mensink RG, Stulp RP, van der Steege G, Buys CH. SMA carrier testing--validation of hemizygous SMN exon 7 deletion test for the identification of proximal spinal muscular atrophy carriers and patients with a single allele deletion.
  Eur J Hum Genet. 2000 Feb;8(2):79-86.
• Sun Y, Grimmler M, Schwarzer V, Schoenen F, Fischer U, Wirth B.  Molecular and functional analysis of intragenic SMN1 mutations in patients with spinal muscular atrophy. Hum Mutat. 2005 Jan;25(1):64-71.
• Sutomo R, Akutsu T, Takeshima Y, Nishio H, Sadewa AH, Harada Y, Matsuo M.  Rapid SMN1 deletion test using DHPLC to screen patients with spinal muscular atrophy. Am J Med Genet. 2002 Nov 22;113(2):225-6.
• Talbot K, Ponting CP, Theodosiou AM, Rodrigues NR, Surtees R, Mountford R, Davies KE.  Missense mutation clustering in the survival motor neuron gene: a role for a conserved tyrosine and glycine rich region of the protein in RNA metabolism? Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3):497-500.
• Thieme A, Mitulla B, Schulze F, Spiegler AW. Epidemiological data on Werdnig-Hoffmann disease in Germany (West-Thuringen). Hum Genet. 1993 Apr;91(3):295-7.
• Velasco E, Valero C, Valero A, Moreno F, Hernandez-Chico C. Molecular analysis of the SMN and NAIP genes in Spanish spinal muscular atrophy (SMA) families and correlation between number of copies of cBCD541 and SMA phenotype. Hum Mol Genet 1996;5:257-263
• van der Steege G, Grootscholten PM, van der Vlies P et al., PCR-based DNA test to confirm clinical diagnosis of autosomal recessive spinal muscular atrophy. Lancet 1995; 345:985-986.
• Vitali T., Sossi V, Tiziano F, Zappata S, Giuli A, Paravatou-Petsotas M, Neri G, Brahe C. Detection of the survival motor nueron (SMN) genes by FISH: further evidence for a role for SMN2 in the modulation of disease severity in SMA patients. Hum Mol Genet 1999; 2525-2532.
• von Gontard A, Zerres K, Backes M, Laufersweiler-Plass C, Wendland C, Melchers P, Lehmkuhl G, Rudnik-Schoneborn S. Intelligence and cognitive function in children and adolescents with spinal muscular atrophy. Neuromuscul Disord. 2002 Feb;12(2):130-6.
• Wang CH, Xu J, Carter TA, Ross BM, Dominski MK, Bellcross CA, Penchaszadeh GK, Munsat TL, Gilliam TC. Characterization of survival motor neuron (SMNT) gene deletions in asymptomatic carriers of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 1996 Mar;5(3):359-65.
• Wirth B, Brichta L, Schrank B, Lochmuller H, Blick S, Baasner A, Heller R. Mildly affected patients with spinal muscular atrophy are partially protected by an increased SMN2 copy number. Hum Genet. 2006 May;119(4):422-8. Epub 2006 Mar 1.
• Wirth B, Herz M, Wetter A, Moskau S, Hahnen E, Rudnik-Schoneborn S, Wienker T, Zerres K. Quantitative analysis of survival motor neuron copies: identification of subtle SMN1 mutations in patients with spinal muscular atrophy, genotype-phenotype correlation, and implications for genetic counseling. Am J Hum Genet. 1999 May;64(5):1340-56.
• Wirth B. An update of the mutation spectrum of the survival motor neuron gene (SMN1) in autosomal recessive spinal muscular atrophy (SMA). Hum Mutat. 2000;15(3):228-37. Review.
• Xu R, Ogino S, Lip V, Fang H, Wu BL. Comparison of PCR-RFLP with allele-specific PCR in genetic testing for spinal muscular atrophy. Genet Test. 2003 Winter;7(4):277-81.

 

 

Cinzia Gellera (Fondazione IRCCS Istituto Neurologico “Carlo Besta”, Milano)